M. Higes, N. Rojo, A. Sanz, M. Suárez, J.L. Pérez, R. Martín, M. de la Cruz.
Centro Apícola Regional. Dirección General de la Producción Agraria. Consejería de Agricultura y Medio Ambiente de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha.
Camino San Martín s/n. 19180 Marchamalo. Guadalajara. España.

Palabras calve: Ascosphaera apis, aceites esenciales, antifungigramas.

Resumen

La ascosferosis de la abeja produce un debilitamiento importante de las colonias. La puesta a punto de un tratamiento que evite la aparición de residuos en los productos de la colmena, pasa por la utilización de sustancias naturales capaces de inhibir el crecimiento del hongo responsable de esta enfermedad.

En este sentido, determinamos la capacidad de cinco aceites esenciales (salvia, melisa, ajedrea, mejorana y limoneno) para inhibir el crecimiento del hongo Ascosphaera apis, agente causal de la ascosferosis de Apis mellifera. Para ello, se puso a punto técnica para la realización de los antifungigramas, que permite obtener tres replicados por placa para la lectura del diámetro de las colonias, una vez estandarizadas las condiciones de cultivo. Se trabajó sobre cepas del hongo aisladas de brotes de campo, de tres provincias diferentes (Soria, León y Guadalajara). Todos los aceites, a excepción del limoneno, mostraron capacidad para inhibir el crecimiento del hongo a concentraciones del 2% en medio de cultivo MY20. Los aceites esenciales de  melisa y ajedrea mostraron el menor CMI (< 2,5ml/ml). Esta capacidad podría ser utilizada para combatir los brotes de esta enfermedad en las colmenas.

Introducción

La ascosferosis es una de las principales enfermedades que actualmente afecta a las larvas de las abejas melíferas (Apis mellifera), cuyo agente etiológico es el hongo Ascosphaera apis (Maasen ex Claussen) Olivie and Spiltoir.

Las medidas de control de esta enfermedad se basarían, fundamentalmente, en la potenciación del comportamiento higiénico de las colonias de abejas (Gilliam, 1990; Palacio et al., 2000), junto con la aplicación de una terapia clásica con sustancias fungicidas. En este sentido, se han probado diferentes antifúngicos, tanto en pruebas in vitro, con in vivo (Heath, 1982; Puerta et al., 1990; Jiménez et al., 1994) sin que por el momento se haya conseguido poner a punto un tratamiento totalmente eficaz en condiciones de campo sobre colmenas en producción. Por otra parte, la aplicación de estas sustancias (captan, benomilo, imidazoles, etc.) puede provocar la aparición de residuos de las mismas en los productos de la colmena (miel fundamentalmente).

La utilización de aceites esenciales extraídos de plantas aromáticas, melíferas en muchos casos, visitadas normalmente por las abejas, representa una terapia más próxima a la biología de la colonia de abejas en el control de las enfermedades, evitando, de otra parte, las repercusiones negativas sobre los productos de la colmena (Colin et al., 1989; Okabe y Saito, 1991; Calderone y Wardell, 1994; Liu, 1995).

En el presente trabajo estudiamos la capacidad de cinco aceites esenciales, procedentes de plantas aromáticas ampliamente distribuidas en nuestra geografía, para inhibir el crecimiento in vitro de tres cepas de campo del hongo Ascosphaera apis.

Material y métodos

Se utilizaron tres cepas de campo de Ascosphaera apis, aisladas a partir de larvas afectadas de ascosferosis procedentes de colmenares de tres provincias diferentes (Guadalajara, León y Soria) y mantenidas en pureza en medio sólido MY20 (Takatori y Tanaka, 1982), mediante pases sucesivos.

Los aceites esenciales seleccionados fueron  los de salvia, melisa, ajedrea, mejorana y limoneno.

Para la realización de los antifungigramas se utilizaron placas de Petri de 90 mm en las que se depositó agar MY20 adicionado de las cantidades correspondientes de cada uno de los aceites esenciales hasta alcanzar las concentraciones de 0%, 0,25%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%. Una vez solidificado el agar, en cada placa, se practicaron tres pocillos de 0,7 cm, con un sacabocados estéril. En éstos se depositaron discos   de agar MY20 con hifas de A. apis, del mismo diámetro, procedentes de los cultivos en pureza de cada una de las tres cepas de campo a estudiar. Una vez inoculadas las placas, se incubaron durante 96 horas a 30ºC en estufa de cultivo. Transcurrido este tiempo se midió el diámetro de cada colonia (tres por placa) con el fin de poder establecer la concentración a la que se inhibe el crecimiento del hongo (CMI), y valorar las posibles diferencias dependiendo del origen de la cepa.

Resultados

En las Figuras 1 a 5 aparecen representados los resultados obtenidos en nuestro trabajo.

A las 96 horas de incubación, las colonias de las placas control (concentración 0%) alcanzan un diámetro de entre 4,9 y 5,5 cm, lo que supone el colapso de la placa por confluencia de las mismas.

Todos los aceites esenciales, a excepción del limoneno, inhiben el crecimiento de las diferentes cepas del hongo a concentraciones del 2% en el medio MY20 (20ml/ml) .

 El CMI para el aceite de melisa y el aceite de ajedrea se situaría por debajo de 2,5 ml/ml. En el caso del aceite de mejorana  y salvia este valor estaría entre 5 y 10ml/ml.

Todas las cepas muestran un mismo comportamiento frente a los diferentes aceites esenciales a excepción de la cepa de Guadalajara frente al aceite esencial de salvia (CMI entre 10 y 15 ml/ml).

Discusión

Los ensayos in vitro muestran la capacidad de diferentes aceites esenciales para inhibir el crecimiento de A. Apis. Sin embargo, para poder comparar los resultados obtenidos por los diferentes autores, es necesario tener presente el método utilizado, ya que son muchas las variables que pueden influir en el resultado obtenido (Carrillo et al., 1994). Las cepas cultivadas en Agar MY20 en tres puntos, según nuestro método, e incubadas a 30ºC muestran ya crecimiento a las 24 horas, llegando a colapsar la placa en 96 horas, lo que facilita la determinación del CMI y permite comprobar si la difusión del aceite esencial en el agar ha sido correcta.

De los aceites esenciales ensayados, los de melisa y ajedrea mostraron un mayor poder inhitorio del crecimiento del hongo, capacidad también comprobada en colmenas afectadas por ascosferosis en condiciones de campo, en el caso de la ajedrea (Colin et al., 1989; Higes et al., 1998).

La menor sensibilidad de la cepa de Guadalajara al aceite de salvia, debería de ser confirmada con el estudio del comportamiento de otras cepas de esta misma provincia frente a este aceite esencial.

Dado que la composición de un aceite esencial puede presentar variaciones según el origen geográfico de la planta, época  y método de recolección, método de extracción del aceite, etc., sería necesario identificar aquellos componentes mayoritarios responsables de la acción inhibitoria para proceder a su estudio de manera individualizada tanto in vitro como en ensayos clínicos realizados en campo.

Conclusiones

El hongo Ascosphaera apis, presenta un crecimiento óptimo sobre agar MY20 a 30 °C, lo que permite valorar el CMI de diferentes aceites esenciales.

Los aceites esenciales de melisa y ajedrea presentan una gran capacidad inhibitoria del crecimiento del hongo.

La determinación de los componentes mayoritarios de estos aceites responsables de la acción antifúngica, resulta imprescindible para poder desarrollar un tratamiento adecuado para su aplicación en colmenas en producción.

Bibliografía

Calderone, N.W., Wardell, G.A. (1994) An in vitro evaluation of botanical compounds for the control of the honey  bee pathogens Bacillus larvae and Ascosphaera apis, and the secondary invader Bacillus alvei. J. Essent. Oil Res. 6, 279-287.

Carrillo, A.J., Abarca, M., Quindos, G. (1994) Pruebas de estudio de sensibilidad a los antifúngicos. I. Factores y variables que influyen en su realización en el laboratorio. Revista Ibérica de micología 11, 105-110.

Colin, M.E., Ducos, J., Larribau, E., Boué, T. (1989) Activité des huiles essentiales de Labiées sur Ascosphaera apis et traitement de d’un rucher. Apidologie 20, 221-228.

Gilliam, M. (1990) Chalkbrood disease of honey bee Apis mellifera, caused by the fungus  Ascosphaera apis: a review of pasant and current research. Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. The XXIII annual meeting of the Society for Invertebrate and Pathology proceedings and abstracts. Adelaide , Australia. 398-402 pp.

Heath, L.A.F. (1982) Development of chalkbrood in honey bee colonie: a review. Bee World 63, 119-130.

Higes, M., Suárez, M., Llorente, J., Payá, M.J., Vicente, A. (1998) Eficacia del aceite esencial de ajedrea en el control de la ascosferosis de la abeja en condiciones de campo. Revista Ibérica de Micología 15, 151-154.

Jiménez, M.I., Aguar, M., Olmo, V., Galiano, A., Soria, A., Martínez, A. (1994) Actividad antifúngica in vitro de IQB-863-F, anfotericina B y derivados imidazólicos frente a Ascosphaera apis. Revista Ibérica de Micología 1, 7-9.

Liu, T.P. (1995) A posible control of chalk brood and nosema disease of the honey bee with neem. American Bee Journal 3, 195-198.

Okabe, T., Saito, K. (1991) Control of chalk brood disease with extracts from Thujopsis doblata. HoneyBee Science 3, 119-128.

Palacio, M.A., Figini, E., Ruffinengo, R., Rodriguez, E., Bedascarrasbure, E. (2000) Changes in a population of Apis mellifera L. Selected for hygienic behaviour and its relation to brood disease tolerance. Apidologie 31, 471-478.

Puerta, F., Flores, J.M., Tarín, R., Bustos, M., Padilla, F., Hermoso, M. (1990) Actividad antifúngica de productos seleccionados contra Ascosphaera apis. Revista Ibérica de Micología 7, 103-106.

Takatori, K., Tanaka, I. (1982) Ascosphaera apis isolated from chalk brood in honey bees. Japanese Journal of Zootechnical Science 2, 89-92.